Autorius: Tumas Beinortas
Ne ląstelinė DNR (angl. cell-free DNA, cfDNA) yra kraujo plazmoje cikuliuojanti DNR, kuri į cirkuliaciją patenka iš suirusių ląstelių. Pastaruoju metu susidomėjimas cfDNA smarkiai išaugo, nes manoma, jog auglio DNR gali patekti į kraujotaką ir gali padėti aptikti ankstyvas auglių formas, kurios dar nepasireiškia jokiais klinikiniais simptomais 1. Tačiau mamos gimdoje besivystančio vaisiaus DNR taip pat patenka į motinos kraują ir sudaro apie 6% motinos kraujyje cirkuliuojančios cfDNA 2. Šis atradimas leido vystytis diagnostikai, kurios metu gilus cfDNA sekvenavimas iš motinos kraujo mėginio leistų vystyti neinvazyvią perinatalinę genetinių ligų diagnostiką. 2012 metais iš motinos ir tėvo kraujo mėginių gilaus sekvanavimo dėka buvo nustatyta pirmoji dar negimusio vaiko pilna DNR seka 3. Dėl techninio paprastumo ir ligų paplitimo, pradinio didžiausio dėmesio susilaukė trisomijų (Dauno, Patau ir Edvardo sindromų) diagnostika.
Iliustracija. Kaip cfDNA panaudojama perinatalinėje diagnostikoje. Paimta iš Bianchi et al. 2012 4
Standartinis trisomijų skryningas susideda iš mamos amžiaus, sprando ultragarso skenavimo, PAPP-A ir, kai kuriose šalyse, ẞHCG kiekio kraujyje. Deja, klasikinis trisomijų identifikavimo algoritmas turi žemą pozityvią prognostinę vertę (PPV) ir susideda iš kelių diagnostinių žingsnių. Kadangi natūrali trisomijų tikimybė yra nedidelė, geram diagnostiniam testui svarbus ne tik aukštas jautrumas, tačiau ir itin aukštas specifiškumas. Balandžio pradžioje New England Journal of Medicine išėjo Norton et al. didelis diagnostinio tikslumo tyrimas, kurio metu cfDNA sekvenavimo tikslumas buvo lyginamas su klasikiniu skryninimo algoritmu standartinėje trisomijų skryningo populiacijoje 5. Šio diagnostinio testo metu yra sekvenuojama visa motinos kraujo cfDNA, dalis kurios yra vaiko cffDNA (cell-free fetal DNA). cffDNA esantis 21/18/13 chromosomų kiekis buvo nustatomas kiekybiškai palyginant jų specifinių DNR fragmentų tankį su kitų cffDNA chromosomomų DNR tankiu.
Šiame kohortiniame tyrime, 35 centruose 15841 moteriai aklai buvo atliekami tiek cfDNA tiek standartiniai trisomijų skryningo testai tarp 10 ir 14 nėštumo savaitės. Trisomijos buvo patvirtinamos klinikinės apžiūros po gimimo metu arba vaiko genetinės informacijos analizės metu. cfDNA tyrimas susidėjo tiktai iš motinos kraujo testo ir laboratorinės jo analizės. Šiame Norton et al. tyrime cfDNA metodu analizuoti kraujo mėginiai aptiko trisomijas su 100% jautrumu [95 % CI, 90.7 – 100%] ir 99.94% specifiškumu [95% CI, 99.89 – 99.97%], AUC (plotas po ROC kreive) buvo 0.999. Tuo tarpu standartinis skryninimo algoritmas turėjo 78.9% jautrumą [95% CI, 62.7 – 90.4%] ir 94.6% specifiškumą [95% CI, 94.2-94.9%], AUC=0.958. Kaip minėjome anksčiau, standartinio algoritmo silpnybė yra nepakankamas specifiškumas, o šiame tyrime PPV buvo tiktai 3.4%. Tai reiškia, jog tik 3.4% standatinio algoritmo identifikuotų kūdikių kaip turinčių trisomiją, išties turėjo trisomiją. cfDNA PPV reikšmė buvo nepalyginamai aukštesnė – 80.9%. Tačiau PPV priklauso nuo ligos paplitimo populiacijoje ir galėtų skirtis tarp skirtingų šalių.
Kitas kol kas tirtas cfDNA pritaikymas perinatalinėje diagnostikoje – tai vaiko RhD statuso nustatymas. Įprastai nėščios moterys, kurioms izoimunizacijos tikimybė yra nemaža, gauna anti-RhD immunoglobuliną net netikrinant vaiko kraujo grupės, nes vaiko grupės tikrinimas yra per daug invazyvus. Chitty et al. 2014 gale publikuotame 2300 moterų įtraukusiame perspektyviniame kohortiniame tyrime cfDNA iš mamos kraujo buvo taikoma vaiko RhD statusui nustatyti 6. Tačiau RhD statusui nustatyti naudojama polimerazės grandinės reakcija, kuri yra pigesnė negu sekvenavimas chromosome skaičiaus sutrikimams diagnozuoti. Po 11 nėštumo savaitės RhD grupės vaikai buvo identifikuojami su >99% jautrumu ir 95% specifiškumu. Rezus statuso nustatymas iš virkštelės kraujo po gimimo buvo naudojamas kaip kontrolinis testas. Ankstyvas ir paprastas vaiko RhD statuso nustatymas iš mamos kraujo leis daug racionaliau naudoti anti-D antikūnius ateityje ir numatyti naujagimio hemolizinio sindromo riziką.
Tiek Norton et al. tiek Chitty et al. tyrimai atlikti atlikti aukščiausio lygmens metodologija – tiek kontrolė tiek cfDNA testavimas buvo atliekami aklai, pacientai buvo sekami iki baigties, o tyrimai įtraukė pakankamai aukštą gimdyvių skaičių. Trisomijų diagnostikos tyrimas buvo finansuojamas Ariosa Diagnostics – įmonės, kuri sukūrė cfDNA testavimo platformą trisomijoms ir turi tiesioginę naudą iš straipsnio. Tačiau aprašyta tyrimo metodika leidžia tikėti, jog demonstruojami rezultatai yra tikri. Šiuo metu platesnis cfDNA panaudojimas diangnostikoje yra limituojamas dėl technologinės sklaidos, patentų suvaržymo ir aukštos testų kainos. Viso vaiko genomo nustatymas ir plataus spektro genetinių ligų diangostika prieš gimimą išliks kontroversiška etinė ir teisinė problema dar ilgą laiko tarpą, tačiau technologiškai tai jau yra įmanoma.
Straipsniai:
1. Bettegowda C, Sausen M, Leary RJ, et al. Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies. Science translational medicine 2014; 6(224): 224ra24.
2. Lo ES, Lo YM, Hjelm NM, Thilaganathan B. Transfer of nucleated maternal cells into fetal circulation during the second trimester of pregnancy. British journal of haematology 1998; 100(3): 605-6.
3. Kitzman JO, Snyder MW, Ventura M, et al. Noninvasive whole-genome sequencing of a human fetus. Science translational medicine 2012; 4(137): 137ra76.
4. Bianchi DW. From prenatal genomic diagnosis to fetal personalized medicine: progress and challenges. Nature medicine 2012; 18(7): 1041-51.
5. Norton ME, Jacobsson B, Swamy GK, et al. Cell-free DNA Analysis for Noninvasive Examination of Trisomy. The New England journal of medicine 2015.
6. Chitty LS, Finning K, Wade A, et al. Diagnostic accuracy of routine antenatal determination of fetal RHD status across gestation: population based cohort study. BMJ (Clinical research ed) 2014; 349: g5243.